杂志名称：Cell Metab.

发表日期：2024.01.23

DOI：10.1016/j.cmet.2024.01.005.

PubMed：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38309268/

影响因子：29.0

肿瘤采用多种策略来逃避免疫系统的攻击。揭示肿瘤抑制抗肿瘤免疫的机制有助于免疫疗法的发展。我们已经确定肿瘤分泌的成纤维细胞生长因子21（FGF21）是一个关键的免疫抑制剂。在多种类型的肿瘤中，FGF21表达上调，并促进肿瘤进展。肿瘤分泌的FGF21显著扰乱抗肿瘤免疫，通过重塑CD8+T细胞的胆固醇代谢。在机制上，FGF21维持激活的CD8+T细胞中AKT-mTORC1-固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）信号轴的高活性状态，导致胆固醇生物合成增加和T细胞耗竭。通过使用中和抗体降低FGF21表达或阻断FGF21可以使AKT-mTORC1信号正常化，并减少CD8+T细胞中过量的胆固醇积累，从而恢复CD8+T细胞的细胞毒性功能，并强有力地抑制肿瘤生长。我们的发现揭示了FGF21作为一个“分泌型免疫检查点”，阻碍抗肿瘤免疫，表明抑制FGF21可能是增强癌症免疫治疗效果的一个有价值的策略。

这篇文章的核心创新性在于识别了肿瘤分泌的成纤维细胞生长因子21（FGF21）作为一个关键的免疫抑制因子。研究发现，FGF21在多种肿瘤中表达上调，并通过重塑CD8+T细胞的胆固醇代谢显著干扰抗肿瘤免疫反应。具体机制是FGF21维持CD8+T细胞内AKT-mTORC1-SREBP1信号轴的高活性状态，导致胆固醇合成增加和T细胞功能耗竭。通过降低FGF21表达或使用中和抗体阻断其作用，可以恢复CD8+T细胞的细胞毒性功能，有效抑制肿瘤生长。

研究意义在于揭示了FGF21作为一个“分泌型免疫检查点”，为癌症免疫治疗提供了新的靶点。通过抑制FGF21，可能为增强癌症免疫疗法的效果提供了一条新的策略路径，为癌症治疗提供了新的思路和方向。

图 1：FGF21表达与肿瘤进展的不良预后相关

(A) 使用对照培养基（CM）或肿瘤条件培养基（TCM）处理的CD8+ T细胞，在经过抗CD3/CD28激活72小时后，通过流式细胞术（FACS）分析IFNg+和granzyme B+的表达情况（n = 3个生物重复）。

(B) 通过细胞因子芯片阵列分析上述指定肿瘤细胞系的CM和TCM中的细胞因子丰度的热图。

(C) 通过酶联免疫吸附测定（ELISA）分析上述指定肿瘤细胞系的CM和TCM中FGF21蛋白水平（n = 3个生物重复）。

(D) 通过ELISA分析正常小鼠与携带肿瘤的小鼠血清中的FGF21蛋白水平（n = 6只小鼠）。

(E) 通过ELISA分析结肠癌患者切除的肿瘤组织及相邻正常组织的组织裂解液中FGF21蛋白水平（n = 29名患者）。

(F) 分析结肠癌患者体内FGF21蛋白水平与肿瘤体积之间的相关性（n = 28名患者）。进行了线性回归分析。

(G) 通过Kaplan-Meier生存分析，比较被分类为FGF21高表达（n = 30名患者）和FGF21低表达（n = 31名患者）的结肠癌患者的生存情况，使用Log-rank检验。

数据表示为均值 ± 标准误差。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001，通过学生t检验进行比较（A 和 C–E）。

图 2：肿瘤细胞中FGF21的缺失通过增强肿瘤浸润T细胞来抑制肿瘤生长

(A) 在接种了对照（shNC）或shFgf21肿瘤细胞的野生型（WT）小鼠中，MC38、E0771和B16-OVA肿瘤的生长曲线（n = 5–8只小鼠）。

(B) 对(A)中携带肿瘤的小鼠血清进行的FGF21水平的ELISA分析（n = 5–8只小鼠）。

(C) 在接种了shNC或shFgf21肿瘤细胞的Rag2^-/-小鼠中的肿瘤生长曲线（n = 5只小鼠）。

(D–F) 通过流式细胞术（FACS）分析shNC和shFgf21肿瘤中的肿瘤浸润T细胞比例（D）、CD8⁺ T细胞凋亡情况（E）以及CD8⁺ T细胞中granzyme B⁺和IFNg⁺的表达（F）（n = 4–6只小鼠）。

(G) 对OT-1 CTLs细胞过继性转移的示意图。

(H) 在接受OT-1 CTLs细胞过继性转移的shNC和shFgf21肿瘤携带的Rag2^-/-小鼠中的肿瘤生长曲线（n = 5只小鼠）。

(I) 在进行OT-1 CTLs细胞过继性转移后，通过FACS分析CD8⁺ T细胞中granzyme B⁺和IFNg⁺的表达（n = 5只小鼠）。

(J) 在CD8⁺ T细胞耗竭后，shNC或shFgf21肿瘤的生长曲线（n = 5只小鼠）。

数据表示为均值 ± 标准误差。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001，ns表示无统计学意义，通过学生t检验（B和E）以及双向方差分析（A, C, D, F, H, I, 和 J）。

图 3：肿瘤分泌的FGF21限制CD8⁺ T细胞的细胞毒作用

(A) shNC和shFgf21肿瘤细胞形成的MC38肿瘤中分选出的肿瘤细胞和T细胞的RNA测序示意图。

(B) 如(A)所述，对肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）进行的Go富集分析。

(C) 如(A)所述，TILs差异表达基因（DEGs）的火山图。

(D) 来自TCGA数据库，比较结直肠癌患者中FGF21高表达组与低表达组的CTL特征的箱线图。

(E) 经过12小时共培养后，OT-1 CD8⁺ T细胞对表达shNC或shFgf21的OVA肿瘤细胞的granzyme B⁺和IFNγ⁺的流式细胞分析（n = 3个生物重复）。

(F) 分析OT-1 CTLs细胞毒性的示意图。

(G) OT-1 CTLs孵育后，表达shNC或shFgf21的OVA肿瘤细胞的溶解百分比（n = 3个生物重复）。

(H) 经过rFGF21处理，或加上免疫球蛋白G（IgG）对照或抗FGF21处理的，经抗CD3/CD28激活的CD8⁺ T细胞的granzyme B⁺和IFNγ⁺的流式细胞分析（n = 3个生物重复）。

(I) 预处理了IgG对照或抗FGF21的，表达OVA的肿瘤细胞，随后与OT-1 CTLs共培养的细胞溶解百分比（n = 3个生物重复）。

数据表示为均值 ± 标准误差。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, ns表示无显著性，通过学生t检验（D和I）和双向方差分析（E, G, 和 H）。

图 4：FGF21促进胆固醇产生，破坏CD8⁺ T细胞的抗肿瘤活性

(A) 利用基因集富集分析（GSEA）分析，研究来源于shNC和shFgf21 MC38肿瘤中肿瘤浸润T细胞的胆固醇代谢基因特征。

(B 和 C) Filipin III染色显示胆固醇含量（B）和抗CD3/CD28激活的CD8⁺ T细胞在对照培养基（CM）或肿瘤条件培养基（TCM）中培养72小时后，胆固醇相关基因的实时PCR分析（C）（n = 3个生物重复）。

(D 和 E) Filipin III染色显示胆固醇含量（D）和抗CD3/CD28激活的CD8⁺ T细胞在经rFGF21处理，或加上IgG对照或抗FGF21处理72小时后，胆固醇相关基因的实时PCR分析（E）（n = 3个生物重复）。

(F) 从shNC或shFgf21 MC38-OVA肿瘤携带的Rag2^-/-小鼠中转移的OT-1 T细胞的Filipin III染色显示的胆固醇含量（n = 5只小鼠）。

(G 和 H) Filipin III染色显示的胆固醇含量（G）和来自shNC或shFgf21 MC38肿瘤的CD8⁺ T细胞的胆固醇相关基因的实时PCR分析（H）（n = 6只小鼠）。

(I) shNC或shFgf21 MC38肿瘤中终末耗竭T细胞的流式细胞分析（n = 5只小鼠）。

(J) 在添加了β-环糊精或胆固醇的条件下，OT-1 CD8⁺ T细胞与表达shNC或shFgf21的OVA肿瘤细胞共培养后，granzyme B⁺和IFNγ⁺的百分比（n = 3个生物重复）。

(K) 添加了β-环糊精或胆固醇后，OT-1 CTLs孵育的shNC或shFgf21肿瘤细胞的溶解百分比（n = 3个生物重复）。

(L) 经过溶剂对照处理或辛伐他汀处理的shNC或shFgf21 B16-OVA肿瘤的生长曲线（n = 5–6只小鼠）。

(M–O) 在(L)中，CD8⁺ T细胞的Filipin III胆固醇染色（M），终末耗竭T细胞（N）和granzyme B⁺及IFNγ⁺ CD8⁺ T细胞的百分比（O）的流式细胞分析（n = 5只小鼠）。

(P) 在常规饮食（ND）和高胆固醇饮食（HCD）喂养的小鼠中，shNC或shFgf21 MC38肿瘤的生长曲线（n = 5–6只小鼠）。

(Q–S) 在(P)中，CD8+ T细胞的Filipin III胆固醇染色（Q），终末耗竭T细胞（R）和granzyme B⁺及IFNγ⁺ CD8⁺ T细胞的百分比（S）的流式细胞分析（n = 5只小鼠（n = 5只小鼠）。

数据以均值 ± 标准误差呈现。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001，ns表示无显著性差异，通过学生t检验（B, D, F, G, I, K, M, N, Q, 和 R）和双向方差分析（C, E, H, J, L, O, P, 和 S）。

图 5：FGF21通过FGFR1-KLB受体维持AKT-mTORC1信号的过度激活，从而在CD8⁺ T细胞中加剧胆固醇生物合成

(A) 使用抗CD3/CD28刺激72小时后，对初始或激活的CD8⁺ T细胞中FGFR1、KLB和FGFR2表达的流式细胞分析。

(B) 抗CD3/CD28激活的CD8⁺ T细胞中p-FGFR1/FGFR1、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-S6K/S6K和p-ERK/ERK的免疫印迹分析（n = 3个独立实验）。

(C–E) 在抗CD3/CD28刺激后的指定时间点，使用对照培养基(CM)或来自shNC或shFgf21 MC38肿瘤细胞的肿瘤条件培养基(TCM)培养的CD8⁺ T细胞中p-AKT、p-mTOR和p-S6K的流式细胞分析（n = 3个生物重复）。

(F) 在抗CD3/CD28刺激72小时后，rFGF21以及IgG对照或抗FGF21处理的CD8⁺ T细胞中p-AKT、p-mTOR和p-S6K的流式细胞分析（n = 3个生物重复）。

(G) 来自shNC或shFgf21 MC38肿瘤的CD8⁺ T细胞中p-AKT、p-mTOR和p-S6K的流式细胞分析（n = 5只小鼠）。

(H 和 I) 在rFGF21处理，或加上雷帕霉素处理72小时后，抗CD3/CD28激活的CD8⁺ T细胞中胆固醇相关基因的实时PCR分析(H)和Filipin III胆固醇染色(I)（n = 3个生物重复）。

(J 和 K) 在抗CD3/CD28刺激72小时后，使用PBS或rFGF21处理的WT、Fgfr1^-/-和Klb^-/- CD8⁺ T细胞中p-AKT、p-mTOR和p-S6K (J)和Filipin III胆固醇染色(K)的流式细胞分析（n = 3个生物重复）。

(L) 在WT、Fgfr1^-/-和Klb^-/- OT-1 CTLs细胞过继性转移后，携带shNC或shFgf21 MC38-OVA肿瘤的Rag2^-/-小鼠的肿瘤生长曲线（n = 5只小鼠）。

(M–P) 在(L)中，p-AKT、p-mTOR、p-S6K (M)，Filipin III胆固醇染色(N)，末端耗竭T细胞的百分比(O)和OT-1 CTLs中granzyme B⁺和IFNγ⁺的百分比(P)的流式细胞分析（n = 5只小鼠）。

数据以均值 ± 标准误差表示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001，ns表示无显著性差异，通过学生t检验(F, I, J, K, 和 M–O)和双向方差分析(C–E, G, H, L, 和 P)。

图 6：抑制FGF21激活的mTORC1-SREBP1恢复CD8+ T细胞功能

(A) 在rFGF21处理，或加上雷帕霉素处理72小时后，抗CD3/CD28激活的CD8+ T细胞中Srebf1表达的实时PCR分析（n = 3个生物重复）。

(B) 在rFGF21处理，或加上雷帕霉素处理72小时后，抗CD3/CD28激活的CD8⁺ T细胞中细胞核的成熟SREBP1（m-SREBP1）和细胞质的前体SREBP1（p-SREBP1）的免疫印迹分析（n = 3个独立实验）。

(C) SREBP1的启动子结合分析。

(D 和 E) 在PBS或rFGF21处理下，抗CD3/CD28激活的shNC或shSrebf1 CD8⁺ T细胞中胆固醇相关基因（D）的实时PCR分析和胆固醇的Filipin III染色（E）（n = 3个生物重复）。

(F) 经CM、TCM或加上雷帕霉素、胆固醇处理72小时后，抗CD3/CD28激活的CD8⁺ T细胞中granzyme B⁺和IFNγ⁺细胞的百分比（n = 3个生物重复）。

(G) 经rapamycin或胆固醇添加后，与表达OVA的肿瘤细胞共培养12小时的OT-1 T细胞中granzyme B⁺和IFNγ⁺的百分比（n = 3个生物重复）。

(H) 经rapamycin或胆固醇预处理24小时后，与OT-1 CTLs共培养的表达OVA的肿瘤细胞的溶解百分比（n = 3个生物重复）。

(I) 在rFGF21处理，或加上雷帕霉素、胆固醇处理72小时后，抗CD3/CD28激活的CD8⁺ T细胞中granzyme B⁺和IFNγ⁺的流式细胞分析（n = 3个生物重复）。

(J) 在PBS或rFGF21处理下，抗CD3/CD28激活的shNC或shSrebf1 CD8⁺ T细胞中granzyme B⁺和IFNγ⁺的流式细胞分析（n = 3个生物重复）。

(K) 经对照或胆固醇预处理24小时后，与shNC或shSrebf1 OT-1 CTLs共培养的表达OVA的肿瘤细胞的溶解百分比（n = 3个生物重复）。

数据以均值 ± 标准误差表示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001，ns表示无显著性差异，通过学生t检验（A, E, H, 和 K）和双向方差分析（D, F, G, I, 和 J）。

图 7：中和FGF21可抑制肿瘤生长，并与抗PD-1阻断发挥协同作用

(A) 在静脉注射了IgG对照或抗FGF21的WT小鼠中，MC38、E0771和B16F10肿瘤的生长曲线（n = 6只小鼠）。

(B 和 C) 如(A)所述，CD8⁺ T细胞中p-AKT、p-mTOR和p-S6K (B)及Filipin III胆固醇染色(C)的流式细胞分析（n = 5–6只小鼠）。

(D 和 E) 如(A)所述，CD8⁺ T细胞中CD8⁺T细胞百分比(D)和granzyme B⁺及IFNg⁺ CD8⁺T细胞(E)的流式细胞分析（n = 5只小鼠）。

(F) 经IgG对照、抗PD-1、抗FGF21或抗PD-1联合抗FGF21处理的MC38、E0771和B16F10肿瘤携带小鼠的肿瘤生长曲线（n = 5只小鼠）。

(G) 如(F)所述，小鼠存活的Kaplan-Meier分析（n = 5只小鼠）。

数据以均值 ± 标准误差表示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001，通过学生t检验(C)，双向方差分析(A, B, D, E, 和 F)，以及log-rank检验(G)。

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