上期内容：肿瘤免疫学-第30章：放射治疗与免疫治疗的协同作用（上）

30.6 平衡行为：辐射在肿瘤微环境中诱发的抗肿瘤免疫的负向调节因子

免疫介导的肿瘤逃逸导致肿瘤进展，这一过程涉及多种免疫抑制途径，不同肿瘤在利用这些途径上各有差异。虽然辐射治疗可以缓解或抵抗其中一些抑制机制，但它也可能加剧其他机制。例如，辐射通过诱导活性氧（ROS）引起的构象变化，导致潜在TGF-β从与其结合的潜伏相关肽中解离，从而实现急性激活。TGF-β是一种强效的免疫抑制细胞因子，对多种免疫细胞具有影响。例如，在TGF-β的存在下，激活的初级CD4⁺ T细胞可能转化为调节性T细胞。目前尚不清楚辐射诱导的TGF-β激活是否与一些研究所报告的辐射诱导调节性T细胞增加有直接关联。此外，正如之前所述，通过TGF-β抑制树突细胞（DC）的激活是辐射引发的抗肿瘤T细胞反应的一个明显障碍。

研究显示，在前列腺癌中辐射会诱导集落刺激因子1（CSF1）的上调，在胰腺癌中则诱导C-C基序配体2（CCL2）的上调，这些变化均会增加髓系细胞向肿瘤的募集。这些被招募的髓系细胞分化为具有免疫抑制作用的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），并参与协调促进血管生成和肿瘤进展的组织修复程序。在高剂量（超过10Gy）的辐射后，这一过程因广泛的内皮细胞死亡而被加剧，尤其是在缺氧条件下。有趣的是，尽管血管细胞的死亡与高剂量辐射治疗相关，但最近一项使用自发致癌模型的研究表明，当在内皮细胞或肉瘤细胞中选择性删除ATM（失调-毛细血管扩张突变）基因时，立体定向放射治疗（SBRT）并未提高这些缺失ATM的内皮细胞的死亡率。尽管这项研究未评估免疫系统在肿瘤根除中的作用，但探讨ATM介导的免疫抑制是否在肿瘤根除中发挥作用将是一个有趣的研究方向。

此外，辐射还能上调缺氧诱导因子-1α（HIF1-α），这是一种关键的转录因子，它不仅促进血管生成，还能在肿瘤微环境中诱导肿瘤细胞和髓系细胞表达PD-L1，从而抑制T细胞介导的肿瘤排斥反应。

因此，辐射的影响极其复杂，取决于多个变量，包括肿瘤类型、原有的肿瘤微环境以及使用的辐射剂量。深入理解达到免疫激活与免疫抑制信号平衡的治疗方案和组合策略，对于最佳利用放射治疗作为原位肿瘤疫苗至关重要。

30.7 重新审视当前治疗方案：局部放疗引发的淋巴细胞减少症

在结合放射治疗进行免疫治疗时，一个重要的实际考虑因素是被照射组织的体积或“场大小”。正如本章初所讨论的，传统的放射治疗技术通常采用广泛的辐射范围，包括涵盖引流淋巴结、邻近骨骼以及造血骨髓。尽管这种方法旨在包括肿瘤边缘的微观病变，但在许多情况下，例如晚期头颈癌，局部复发率仍高达约40%，即便是在总剂量大、CTV广、短期和长期毒性显著的情况下。传统的放射生物学常常将这些治疗失败归咎于辐射剂量不足或照射范围边缘不足。然而，随着对辐射在激活免疫系统以控制癌细胞方面作用的认识加深，这种模式正在被重新评估。大范围辐射的一个主要副作用是在辐照区域内杀死驻留或循环的淋巴细胞（在辐射传递过程中被暴露）。由于淋巴细胞对辐射极为敏感，它们的减少降低了参与肿瘤排斥反应的可用细胞数量。

放射诱导的淋巴细胞减少已经在多形性胶质母细胞瘤的研究中得到证实，这种肿瘤通常涉及大脑这一高度灌注的器官，并经常接受大范围放射治疗。在接受标准治疗的患者中，40%发生严重和持续的治疗相关淋巴细胞减少。重要的是，淋巴细胞减少被证实与生存期缩短相关：CD4计数在2个月内低于200时，死亡风险比为1.66（p=0.03）。这一发现突显了在设计治疗方案时考虑免疫保护的重要性。

在一项预测血液影响的模型研究中，计算出循环淋巴细胞的平均辐射剂量为2.2 Gy，并且在30次治疗后，根据使用的辐射范围，有99%的循环血液接受了至少0.5 Gy的辐射。为了研究局部晚期胰腺癌治疗边缘对淋巴细胞减少的影响，最近对立体定向放射治疗与标准三维放射治疗域的总淋巴细胞计数进行了比较。结果显示，在两个月时，与立体定向治疗相比，标准治疗组中有46%的患者淋巴细胞数显著减少，与13.6%的患者相比。此外，治疗后较高的总淋巴细胞计数与生存期的延长显著相关，这进一步表明了大范围治疗区域的不利影响。

放射治疗期间照射循环T细胞可能对免疫记忆的维持产生显著影响，而免疫记忆依赖于持续的细胞稳态转换。此外，还有报告指出T细胞的功能可能受到损害。从患者外周血中采集的T细胞在体外重新刺激后，其增殖能力减弱，且在放射治疗结束四周后仍可检测到这种损伤。放疗后淋巴细胞的持续减少与细胞因子反应持续失败有关。因此，在设计放射治疗方案时考虑照射组织的体积和治疗的分数显得尤为关键。初步证据表明，传统的分割放射治疗方案应避免将每日治疗延长至4-8周，尤其是当照射大靶体积时。这一点对于放射治疗和免疫治疗成功组合至关重要。

30.8 利用辐射效应提高免疫治疗的反应

抗肿瘤免疫反应的启动期和效应期受到多个检查点的调控，这些检查点必须被克服以产生临床有效的肿瘤排斥反应。目前，已批准或正在研究的免疫疗法针对一个或几个这样的检查点，但在很多情况下这些治疗未能引发显著的临床反应。放射治疗在免疫反应的启动期和效应期都具有潜在的调节作用，这使得它在与各种免疫疗法组合时显示出特别的优势。相关的临床前研究示例列在Table 30.1中。虽然Table 30.1并未涵盖所有相关文献，但所提供的数据强有力地支持了放射治疗可以与不同策略协同作用以提高肿瘤控制的假设。

有趣的是，不同研究中测试的放射剂量差异很大，但只有少数研究同时测试了不同的剂量和分割方法，在大多数情况下，这些研究并未能明确最有效的剂量。此外，只有极少数研究详细检查了这些治疗组合对体外肿瘤模型的影响。尽管场内控制是实现远隔效应的必要条件，但增强的场内反应并不一定能转化为系统性的治疗效果。因此，我们应谨慎地利用临床前数据来推断哪些辐射剂量应在临床研究中进行测试。

Table30.1 展示了在临床前肿瘤模型中，放射治疗如何改善对多种免疫疗法的反应。CEA：癌胚抗原；CpG：C-G富集的合成寡脱氧核苷酸；CTLA-4：T淋巴细胞相关抗原4；DC：树突状细胞；GM-CSF：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；i.p.：腹腔注射；i.v.：静脉注射；MDSC：髓源性抑制细胞；MHC：主要组织相容性复合体；NK：自然杀伤细胞；PD-1：程序性死亡-1；皮下注射；TAM：肿瘤相关巨噬细胞；TLR：Toll样受体。

30.9 放射治疗与免疫治疗组合的临床转化：一项进行中的工作

在临床前模型中显示出相加性或协同效果的放射与免疫治疗组合，目前已在临床上进行了测试。开创性的研究测试了使用生长因子（如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，GM-CSF）或TLR激动剂（如CpG）来增强抗原呈递细胞功能和/或激活的策略，这在实体瘤和淋巴瘤中分别实现了接近30%的远隔效应。

最近，针对CTLA-4和PD-1信号通路的检查点抑制剂取得了突破性成功，导致FDA迅速批准了多种药物（包括nivolumab、pembrolizumab、ipilimumab和atezolizumab）用于治疗转移性黑色素瘤、肺癌、肾细胞癌、尿道上皮癌、头颈癌和霍奇金淋巴瘤。然而，根据不同的疾病类型，单一检查点抑制剂的反应率大约保持在15-30%左右，并且在多数情况下会出现耐药性。因此，目前有近100项试验正在研究辐射与这些药物联合使用是否能够克服耐药性，以及是否能够产生更为强烈和持久的治疗效果。这些研究大多数处于I/II期阶段；然而，目前也有针对非小细胞肺癌（NCT02768558）、头颈癌（NCT03040999）和胶质母细胞瘤（NCT02617589）的III期研究在测试辐射和PD-1抑制剂组合的效果。

在一项III期临床试验中，799名接受多西他赛治疗后病情进展的去势抵抗性转移性前列腺癌患者被随机分为两组。这两组患者分别接受了单次8 Gy针对骨转移的放射治疗，随后每三周接受一次伊匹单抗（10 mg/kg）或安慰剂，最多接受四次。与接受安慰剂的对照组相比，接受伊匹单抗的组中并未观察到显著的生存率提高。然而，在具有较好预后特征且无内脏转移的患者中，伊匹单抗提高了中位生存期，这提示选择病情较轻且可能具有较好免疫功能的患者进行此类治疗可能十分重要。

此外，已有两项I期试验的结果发布，这些试验测试了放疗与伊匹单抗联合治疗转移性黑色素瘤的效果，每项试验均纳入了22名患者。在这两项研究中，观察到的毒性与单独使用伊匹单抗的预期毒性相似。在第一项研究中，18%的患者实现了部分缓解（这是最佳结果），另外18%的患者在未接受放疗的病灶中病情稳定，这与单用伊匹单抗的预期效果相似。在第二项研究中，27.3%的患者实现了客观缓解，其中包括3例完全缓解和3例部分缓解，另有22.7%的患者病情稳定。单独使用伊匹单抗的黑色素瘤患者中很少见到完全缓解，这表明放射治疗可能确实增强了治疗效果。值得注意的是，这两项研究在放疗与伊匹单抗给药的顺序上存在差异：第一项研究在放疗后3-5天给药，而第二项研究在放疗前5天内给药，这暗示了治疗的顺序可能至关重要。在临床前研究中，也已证明在放疗前或放疗过程中给予免疫检查点抑制剂比放疗后给予更为有效。

一项I/II期临床试验（NCT02239900）的I期结果已公布，该试验检测了在晚期实体肿瘤中，包括非小细胞肺癌（NSCLC，8例）、结直肠癌（4例）、肉瘤（3例）和肾细胞癌（3例），共31名患者接受SBRT联合伊匹单抗治疗的体外反应。SBRT以12.5 Gy × 4次或6 Gy × 10次的剂量配比，与伊匹单抗同时给予或在第二次给药后1周连续给予，用于治疗肝脏或肺部转移。有23%的患者获得临床效益（非辐射区病灶部分缓解或疾病稳定持续6个月以上）。这一结果对于那些已知对伊匹单抗无反应的肿瘤类型来说，是非常鼓舞人心的，但要确定辐射剂量、照射部位或伊匹单抗的给药顺序是否会影响效果，目前还为时尚早。外周血CD8⁺ T细胞和CD8/CD4 T细胞比率的增加与临床获益相关。有趣的是，接受肝脏放疗的患者中，一些T细胞激活标记物的表达高于接受肺部放疗的患者，但这一现象仍需进一步验证。

研究团队在ASTRO会议上报告了一项II期临床试验（NCT02221739）的结果，该试验测试了放疗和伊匹单抗治疗化疗难治性转移性非小细胞肺癌（NSCLC）。在21名患者中，接受了6 Gy × 5次或9.5 Gy × 3次的放疗，并在放疗期间给予了首剂伊匹单抗，随后完成了4个周期的伊匹单抗治疗，33%的患者出现了部分或完全的异位反应。生存随访仍在进行中，但这项小型研究的数据显示，放疗刺激了对伊匹单抗的反应，并表明与单独使用伊匹单抗相比，联合治疗可能更为有效。

联合放疗和阻断其他免疫抑制途径的研究也取得了有希望的结果。由于TGF-β在辐射诱导纤维化中的作用以及其抑制抗肿瘤免疫反应的能力，它成为一个有吸引力的靶点。正在进行的临床试验正在评估抗体中和TGFβ以及TGFβ受体小分子抑制剂与放疗联合使用，治疗转移性乳腺癌（NCT01401062）、非小细胞肺癌（NCT02581787）、直肠癌（NCT02688712）和胶质瘤（NCT01220271）。

TLR激动剂已成功用于克服免疫抑制的肿瘤微环境。例如，TLR7激动剂咪喹莫特能增强树突细胞的成熟和抗原呈递能力，并促进向Th1型免疫响应的偏向，以及增加T细胞的归巢。在乳腺癌皮肤转移的小鼠模型中，临床前数据表明，外用咪喹莫特与低剂量分割放疗结合，在CD8⁺ T细胞依赖的方式中抑制肿瘤生长，并与环磷酰胺诱导的免疫记忆共同作用。这些发现为针对胸壁复发或皮肤转移的乳腺癌患者的一项II期临床试验（NCT01421017）提供了科学依据。

PD-1/PD-L轴，包括程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）及其配体（PD-L1和PD-L2），是维持外周耐受的重要生理机制之一。它在控制细胞毒性T细胞反应的规模方面起着关键作用，并在几乎所有类型的炎症状态中都有所涉及。PD-1在活化的T细胞和B细胞上表达，其表达是由TCR依赖的激活诱导的，尽管表达水平和持续时间会受到激励的性质和持续性的影响。PD-L1和PD-L2通常由一部分巨噬细胞表达，但也可以在多种造血细胞和非造血细胞中被各种炎症细胞因子诱导。PD-1/PD-L1轴参与抑制T细胞的核心功能，包括细胞因子的产生、细胞增殖和细胞毒性颗粒的形成。

基于在治疗淋巴瘤中使用TLR9激动剂及肿瘤靶向辐射的积极数据，一项新研究旨在通过添加Flt3L并将Toll样受体（TLR）激动剂更换为poly-ICLC来改善低级别B细胞淋巴瘤的治疗效果，其中poly-ICLC被认为是Flt3L招募的树突细胞的最佳TLR激动剂。

30.10 使用放射治疗诱导个性化肿瘤疫苗

肿瘤基因组中的突变有时会编码出具有免疫原性的蛋白质（即新抗原），这些新抗原在很大程度上是每个肿瘤特有的。新抗原作为治疗靶标非常有吸引力，因为它们通常不会引起免疫系统的耐受性反应，而且肿瘤的选择性表达这些新抗原可以最小化自身免疫的风险。然而，诱导对这些新抗原的免疫反应需要高度个性化的策略。在这方面，相较于深度测序和生物信息学的计算机预测方法，放射治疗提供了一种更快速、经济的方式来生成个性化肿瘤疫苗。尽管如此，关于如何使用放射治疗来启动有效的肿瘤特异性T细胞反应的最佳方法仍有许多未解决的问题。目前正在积极研究的方面包括组织学特性、放射剂量和分割方式、照射部位、治疗顺序以及所使用的免疫疗法。此外，患者的个体特性，如遗传背景、免疫相关基因的多态性、肿瘤的遗传和表观遗传特征、翻译后调控路径，以及包括温度、代谢和微生物组在内的环境因素，都可能影响放射治疗生成原位肿瘤疫苗的效果。

迫切需要识别可预测的生物标志物，以便为患者选择和定制治疗方案。目前，在非小细胞肺癌（NSCLC）中，广泛使用PD-L1免疫染色作为预测帕姆单抗免疫治疗反应的生物标志物。新兴的生物标志物包括“免疫评分”，这是基于治疗前肿瘤样本中浸润免疫细胞的综合分析，它不仅反映了肿瘤微环境的整体免疫原性，还可能指明哪些免疫细胞是最佳的治疗靶标（例如，肿瘤抑制的巨噬细胞与调节性T细胞）。除了微环境指标外，通过肿瘤的突变负荷或新抗原负荷来测量肿瘤细胞的基因组特征已显示出其预测价值。例如，在NSCLC中，较高的突变和新抗原负荷均预示着对抗PD-1免疫治疗的良好反应。具有DNA修复缺陷（如错配修复缺陷）的肿瘤也表现出更好的对抗PD-1免疫治疗的反应。最后，患者之间的单核苷酸多态性（SNPs），这些与肿瘤突变无关的微小遗传差异，其作用也开始被认识到。例如，PD-L1中的SNPs已被证实在预测化疗反应中具有潜在价值。

虽然在诊断时深入了解患者的癌症免疫状态和遗传特征非常重要，但已经清楚地认识到，即使患者对免疫治疗有初步反应，大多数患者最终还是会出现病情进展。因此，探究免疫逃逸机制至关重要。尽管最初的活检和血液测试有助于为适当的治疗提供指导，但鉴于肿瘤在免疫压力下的遗传演变或“免疫编辑”反应，可能需要在癌症进展的各个阶段对肿瘤和免疫细胞进行采样，以便为治疗干预提供数据支持。为此，“液体活检”或利用外周血样本作为肿瘤群体的代表，提供了一种长期监测患者的微创策略。

综上所述，放射治疗和免疫治疗的组合在特定情况下展现出显著效果，例如在一项研究中，对晚期化疗难治性的转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者进行非消融性照射并联合使用四剂伊匹单抗治疗后，患者超过四年仍无肿瘤复发，这一结果激发了极大的热情。然而，此类反应仍然相对罕见。研究者仍在学习如何最佳地结合放射和免疫治疗，并在临床前和临床试验设计中考虑众多因素。最终，将由患者特定的因素来指导治疗方案的选择和实施。