抗CTLA-4疗法的作用机制仍然不完全清楚。有假设认为其疗效可能源自CTLA-4:B7结合的拮抗作用或是通过Fc效应器介导的调节性T细胞（Treg）的消耗。Lax等人使用工程化抗体研究了这两种机制，通过测试单独和联合的拮抗与Treg消耗特性，以确定哪种机制导致了抗肿瘤效果。他们的研究结果最近在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上发表。

研究人员利用酵母表面展示（YSD）技术和以DNA结合蛋白Sso7d为框架的文库，来识别与B7非竞争性结合的CTLA-4结合物。他们选择并富集了对CTLA-4-Fc有最高亲和力的结合物，筛选过程在过量的B7.1-Fc存在下进行，以消除那些针对CTLA-4上的B7.1结合位点的结合物。这导致了一个单克隆（b1s1），其对细胞表面CTLA-4的单体亲和力无法检测。经过两轮的亲和力成熟后，制备了一个二聚体mIgG2c-Fc融合体，创造了“非拮抗性”b1s1e2-Fc。作为对比，研究人员使用了“拮抗性”mIgG2c 9d9抗体，它能竞争性地抑制B7与CTLA-4的互作。b1s1e2-Fc和9d9对细胞表面CTLA-4的亲和力相近，因此可以对这两种疗法进行比较。

为了确认b1s1e2-Fc与B7.1结合的抗原决定簇（epitope）不同，研究者开发了一个酵母表面展示（YSD）系统，通过在酵母表面展示的CTLA-4突变库进行抗原决定簇映射，并富集了无法结合B7.1-Fc或b1s1e2-Fc的CTLA-4变种。b1s1e2-Fc的抗原决定簇映射表明，F67这一单个残基对其结合是必需的，这一残基位于CTLA-4的另一个环中，与已知能够结合B7的典型“MYPPPY”区域不同，从而确认了一个不同的抗原决定簇。当比较b1s1e2-Fc与CTLA-4WT和CTLA-4F67L的结合情况时，9d9对两者的结合力一样，而b1s1e2-Fc只能结合CTLA-4WT。

由于CTLA-4的细胞外区域较小，如果立体阻碍阻止了b1s1e2-Fc和B7的结合，那么一个独立的抗原决定簇可能不足以完全非竞争性地抑制B7。为了检验这一点，研究者测量了CTLA-4结合到B7.1包被板的结合亲和力的降低，并将其与CTLA-4包被板进行了比较。结果表明，即使CTLA-4与B7.1结合，b1s1e2-Fc也能结合CTLA-4，而在这种情况下，9d9的结合力会降低。由于CTLA-4的拮抗作用会阻断CTLA-4:B7轴，并阻止CTLA-4对B7进行跨内吞作用，所以通过在存在CTLA-4结合物的情况下，用表达CTLA-4的受体细胞与含有B7.1或B7.2的供体细胞孵育，来测量b1s1e2-Fc对B7跨内吞作用的影响。经过一夜孵育后，剩余的配体对于b1s1e2-Fc或无抗体而言相似，而9d9则导致B7.1和B7.2的数量增加，这表明b1s1e2-Fc并未功能性地阻止CTLA-4，或抑制跨内吞作用。

至于Treg消耗的评估，研究人员使用了MC38结肠癌小鼠模型。小鼠皮下(SC)接种肿瘤细胞，然后在第7天腹腔(IP)或瘤内(IT)注射b1s1e2-Fc和9d9。一天后，对肿瘤进行分析。b1s1e2-Fc和9d9都能减少肿瘤中的Tregs。研究人员还通过在Fc中引入LALA-PG突变来去除与FcγRs的结合，从而创建了沉默Fc结构的方法，而这种方法本身不会耗尽Tregs。

接下来，研究人员确定了每种构建物及其静默Fc形式的治疗效果。拥有SC MC38肿瘤的小鼠在第7、10和14天通过IT或IP方式接受了这些构建物的剂量，然后评估了其生存情况。与对照小鼠相比，接受9d9 WT或b1s1e2-Fc WT的IT治疗的小鼠生存率显著提高，但9d9 WT治愈了更多小鼠（47%），而b1s1e2-Fc则没有治愈（0%）。静默Fc的9d9结果与对照小鼠的生存状况相似，这表明单独的CTLA-4拮抗疗法并不有效。由于b1s1e2-Fc并不拮抗CTLA-4，静默Fc完全消除了其治疗效果。IP给药的效果与IT治疗相似。总的来说，9d9 WT比b1s1e2-Fc带来了更大的益处，这表明CTLA-4拮抗和肿瘤内Treg耗竭同时发生会带来最好的反应。

接下来，研究人员评估了治疗对肿瘤引流淋巴结（TDLN）的影响。携带MC38的小鼠在第7天接受剂量，第10天进行TDLN评估。与对照或b1s1e2-Fc治疗的小鼠相比，接受9d9治疗的小鼠中Ki67⁺PD-1⁺ CD4⁺和CD8⁺效应T细胞以及Ki67⁺ Tregs的频率增加，这表明CTLA-4拮抗是增强T细胞启动的必要条件。

在对照小鼠中，肿瘤中的Tregs的CTLA-4⁺ Tregs的百分比和CTLA-4的表达水平比TDLN中的Tregs更高。由于TDLN中的Tregs在表面上的CTLA-4水平不足以诱导消耗，因此这些Tregs的激活是9d9的治疗结果。9d9的治疗导致TDLN中的Treg在治疗后3天内比效应T细胞扩增得更多，这可能是由于Tregs的CTLA-4表达水平高于效应T细胞。由于这可能会抑制一些效应T细胞的启动，因此研究人员推测除了肿瘤Tregs外，消耗TDLN Tregs可能会提高效果。研究人员利用了Foxp3-DTR小鼠模型进行评估。这个模型允许通过使用白喉毒素（DT）进行选择性的Treg清除。使用低剂量的IT DT给药进行局部Treg消耗，研究结果显示，局部Treg消耗导致肿瘤内效应CD4⁺ T细胞的增加，以及效应CD8⁺ T细胞的非显著增加。TDLN中的CD4⁺或CD8⁺效应T细胞的频率没有差异。使用这种模型，接种MC38或B16F10肿瘤并从第7天开始使用DT进行治疗，每两天给药一次以维持肿瘤和TDLN中的Treg消耗，其生存率比对照小鼠有所提高。

本研究中的数据表明，Treg消耗和CTLA-4拮抗对于这种治疗的效果均至关重要。肿瘤和TDLN中的Treg消耗可以导致T细胞的更有效启动；然而，由于TDLN Tregs的CTLA-4表达量低，当前针对CTLA-4的临床抗体并未针对它们。因此，这项研究的结果暗示，诱导这些Tregs消耗的新型疗法可能是一种好的组合策略，有助于提高抗CTLA-4治疗的效果。

第一作者Brianna M. Lax和通讯作者K. Dane Wittrup回答了我们的问题。

BML: 对我来说最令人惊讶的发现之一是，使用白喉毒素在肿瘤内和淋巴结内消耗Treg比传统的抗CTAL-4抗体更有效。虽然我们发现淋巴结中的T细胞启动对治疗至关重要，但我没想到相关的淋巴结Treg增殖如此有害。白喉毒素的研究表明，淋巴结中的Tregs在抑制免疫系统方面有多么强大。

KDW: 我对抗CTLA-4抗体对淋巴结中Tregs的无效消耗感到惊讶，这很可能是由于与肿瘤相比，该区域中CTLA-4的表面水平较低。考虑到淋巴结驻留Tregs在抑制CD8⁺ T细胞启动中的重要性，这是有问题的。

BML: 这些发现为下一代检查点抑制剂的开发提供了有价值的见解。这项工作支持开发具有增强Treg消耗能力的人类抗CTLA-4抗体，同时也强调了消耗淋巴结Treg的治疗潜力，并为开发能够做到这一点的疗法提供了动力。

KDW: 最后，Bri的非常酷的非竞争性CTLA-4结合物并未解决淋巴结Treg消耗的难题。然而，我相信它确实为理解CTLA-4配体拮抗作用和Treg消耗在治疗效果中的复杂需求提供了新的视角，因此，它可能会帮助未来的抗体开发者构思出替代策略。

BML: 我最近去了墨西哥的瓦哈卡，并在Chacahua国家公园的发光的泻湖中游泳。在那里，我了解到这些神奇的浮游生物只能生活在70%的盐水和30%的淡水形成的半咸水中。这些生物利用荧光酶催化氧化反应，以约98%的惊人效率释放光线！这些生物正在证明，酶是那些最酷的蛋白质。

KDW: 佩戴Fitbit四个月的经验告诉我，我并没有我以为的那么自律。我没有改变我假设的锻炼计划，只是让这个专制的手表羞辱我以达到全面遵守，结果我的血压和静息心率都有所改善。（我想这就是一个60岁的教授与游泳与神奇的浮游生物相比，更为兴奋的事情。）