导 读

在免疫监视理论复兴和免疫检查点阻断剂获得批准之前，癌症通常被认为是一种细胞自主性疾病，是完全由恶性细胞的遗传和表观遗传改变而引起的。

因此，治疗性干预的设想是利用癌细胞固有的脆弱性(使它们特别容易受到抗增殖和细胞毒性的影响的特性)，或者利用其在恶性肿瘤细胞中特异激活但在正常细胞中不存在的靶向途径(很像影响细菌酶但不影响宿主酶的抗生素)。

基于这种方式，细胞毒性和靶向疗法的开发遵循了以下工作流程：首先在培养的人类细胞系上鉴定出抗癌药物，然后在携带人类癌症的免疫缺陷小鼠身上进行测试，最后将其引入临床。

貌似这一策略已经成功地开发了几种化疗药物。特别是涉及几种不同细胞毒剂的联合疗法，在降低经过辅助化疗后的乳腺癌和结直肠癌复发的风险方面非常成功。

此外，针对几种致癌酪氨酸激酶(例如在慢性髓系白血病中激活的BCR-ABL激酶和在胃肠道间质瘤中激活的酪氨酸激酶生长因子受体KIT)的第一种靶向抗癌药甲磺酸伊马替尼的成功，使人们相信癌症可以用特定药物治疗(尽管后来证明伊马替尼的治疗效果依赖于NK和T淋巴细胞)。

我们实验室一直坚持这种以癌症细胞为关注点的治疗观念，直到在2004年进行了一个极其简单的实验。

我们将小鼠结直肠癌细胞系CT26移植到免疫活性BALB/c小鼠(CT26最初的来源)或免疫缺陷的nu/nu裸鼠(无胸腺而不能产生T淋巴细胞)的皮下，并对新出现的肿瘤进行了以蒽环类阿霉素为基础的化疗。但令我们失望的是，CT26肿瘤的生长只有在具有免疫活性的环境下才会减少(在BALB/c小鼠中)，而不是在nu/nu裸鼠上。因此，化疗的效果取决于细胞免疫反应。

另一个意外出现于我们分析阿霉素在CT26细胞中诱导细胞死亡的方式时。

当时，人们只知道两种主要的细胞死亡途径，即细胞凋亡和细胞坏死。细胞凋亡是发育过程中细胞死亡和维持成年组织内稳态的生理途径。细胞坏死则被认为是一种纯粹的病理途径，由于细胞内容物不受控制地通过通透性质膜溢出而导致促炎反应。

在CT26细胞中，阿霉素诱导了细胞凋亡途径的两个特征，即线粒体内跨膜电位的早期丧失和caspase的激活。加入药物半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂（凋亡抑制剂）可阻止细胞呈现核固缩和碎裂的凋亡形态，并导致更严重的坏死表型。

当阿霉素处理后凋亡的CT26细胞被注射到BALB/c小鼠皮下时，它们诱导了一种免疫反应，并保护小鼠免受之后活的CT26细胞的攻击（这些细胞在一周后被注射到另一侧皮下）。相比之下，阿霉素处理的坏死CT26细胞(在Z-VAD-fmk存在下被杀死)未能激活这种免疫反应。

这些结果支持了一种新的caspase依赖的凋亡方式，这种方式可以刺激抗癌免疫监视的产生，我们称之为“免疫原性细胞死亡”(ICD)。

后来发现，CT26细胞缺乏受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)的表达，RIPK3是坏死性凋亡(坏死的一种调节形式)所需的一种蛋白质，而其他拥有坏死性凋亡所需的全部分子机制的小鼠癌细胞株可以刺激对包括蒽环类药物在内的细胞坏死性凋亡进行ICD。因此，不同形式的调节性细胞死亡(凋亡和坏死性凋亡)都可能导致ICD。

基于在多种不同类型的癌细胞和小鼠身上反复出现的上述结果，我们假设ICD将构成一个重要的机制，并导致肿瘤内局灶性细胞凋亡和坏死性凋亡的细胞的自主化疗反应转化为全身免疫介导的反应，同时可以放大和延长化疗的抗癌作用。

换句话说，ICD会将癌症转化为自己的疫苗。

我们还发现，并非所有化学治疗剂在引起 ICD 方面都同样有效，观察到蒽环类和奥沙利铂在此方面特别有效，而许多其他细胞毒剂则效果不明显。

在随后的研究中，我们观察到 ICD 诱导剂能够触发死前应激反应，例如自噬和内质网 (ER) 应激，从而导致ICD所需的DAMPs的释放和暴露。 

因此，不仅仅是细胞死亡本身产生 ICD ，还有一系列应激途径和事件也产生ICD 。本章将讨论ICD产生途径及其与 DAMP 暴露或释放的联系，以及它们的临床意义。

膜联蛋白A1(Annexin A1)

膜联蛋白A1(Annexin A1，ANXA1)是一种相对丰富且普遍表达的细胞质蛋白，是对濒死的癌细胞使用蒽环类药物或奥沙利铂进行体外化疗后释放出来的。

尽管ANXA1的近亲–膜联蛋白A2(ANXA2)已被证明是通过一种非常规途径分泌的，ANXA1确切的释放方式尚不清楚。当细胞死亡时ANXA1可以通过渗透性升高的质膜被动释放。

通过 CRISPR/Cas9 技术去除了 ANXA1 的小鼠癌细胞系不能在体外进行 ICD(这意味着，如果它们与蒽环类药物共培养，然后在体内注射，它们将无法诱导保护性的抗癌免疫反应)。因此全身注射蒽环类药物或奥沙利铂，在体内也不能抑制ANXA1缺陷型癌细胞的生长和发展。

ANXA1可与甲酰肽受体-1(FPR1)结合，FPR1是一种主要由髓系细胞表达的七次跨膜G蛋白偶联受体。在宿主免疫系统中敲除FPR1(以及将FPR1缺陷的造血干细胞转移到FPR1含量正常且被辐射的宿主中)导致宿主无法对濒死的癌细胞产生抗癌免疫反应。

此外，免疫系统中缺少FPR1导致在体内无法控制使用了蒽环类药物或奥沙利铂治疗的癌症的生长。

这些结果强调了ANXA1和FPR1之间的相互作用对于化疗所触发的癌细胞与免疫系统间作用的重要性。

从机制上讲，FPR1引导肿瘤内分化中的树突状细胞迁移到濒死的癌细胞附近，促使树突状细胞介导 肿瘤相关抗原的摄取，并随后将其呈递给T细胞(Fig.12.1)。

因此，FPR1缺陷的宿主无法启动由CD8⁺T细胞介导的针对肿瘤抗原的免疫应答。

上述发现是在鼠身上获得的，并得到了癌症患者流行病学研究的支持。

FPR1(A299G)功能缺失突变影响其N端蛋白的胞内结构域，抑制了激活所需受体的二聚化，在两种类型的癌症中具有负面预后特征。

携带FPR1功能缺失等位基因的乳腺癌患者在接受基于蒽环类药物的辅助化疗时，与携带两个正常等位基因FPR1的患者相比，表现为无进展和总生存期更短。这一发现是从两个独立的乳腺癌患者队列中得出的。

此外，从统计学来看，携带两个FPR1功能缺失等位基因的结直肠癌患者在基于奥沙利铂的辅助化疗中，比携带一个或两个FPR1正常等位基因的患者的生存期更短。造成这些差异的机制基础尚不清楚。

此外，乳腺癌细胞的ANXA1水平似乎比正常上皮细胞低，这可能反映了免疫选择有利于缺乏DAMP ANXA1的癌症。

Fig12.1 膜联蛋白A1介导的树突状细胞归巢。膜联蛋白A1(ANXA1)是癌细胞针对于某些治疗方法的反应释放的，包括基于蒽环类和草酸铂的化疗诱导的免疫原性细胞死亡。在趋化作用的驱动下，未成熟的树突状细胞(IDCs)以依赖于FPR1的方式定位于它们的靶点，并能靠近濒临死亡的癌细胞和抗原提呈细胞。FPR1：甲酸基肽受体1

ATP

在体外化疗药物治疗时，癌细胞将ATP释放到培养上清液中，可以通过喹嗪标记的含ATP的溶酶体隔室的减少观察到。伴随的细胞外ATP水平的增加可以通过萤火虫荧光素酶的结构来检测，该结构系在癌细胞表面，并在加入d-荧光素后能检测到细胞周围的ATP。该系统适用于化疗后2天荧光信号强烈增强的荷瘤小鼠的细胞外ATP的测定。

ATP释放的机制尚未完全阐明，但似乎涉及溶酶体的分泌机制，该机制至少依赖于两个过程，即死前的自噬反应和caspase的激活。

自噬发生从而允许ATP从溶酶体重新分布到自噬溶酶体，并通过一种需要溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)的机制来分泌，该蛋白以caspase依赖的方式移位到质膜上。

ATP的释放还涉及caspase介导的Rho相关螺旋线圈蛋白激酶(ROCK1)的激活，导致肌球蛋白II依赖性的膜出芽以及pannin 1(Panx1)通道被caspase切割后的开放。

虽然自噬和 LAMP1 不影响 PANX1 通道开放，但 ICD 相关的 LAMP1 移位至质膜需要 PANX1。

因此，细胞凋亡相关的 ATP 释放是一个复杂的过程，在自噬缺陷型的肿瘤中是被阻断的，因为自噬失活发生的相当频繁，尤其是在早期肿瘤中。

通过RIPK3和混合谱系激酶结构域样假激酶(MLKL)的坏死信号也可能促进ATP的释放，尽管目前尚不清楚这一过程是否也需要死前自噬来诱导。

在任何情况下，似乎被操纵以抑制自噬过程的癌细胞在体内用蒽环类药物或奥沙利铂治疗后都不会经历ICD，也不会减少它们的生长。

通过在癌细胞上过度表达胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶1(ENTPD1，也称为胞外ATP酶CD39)，可以获得类似的 ICD 消除和化疗反应。

细胞外ATP作用于两类嘌呤能受体，即代谢型受体P2Y2和离子型受体P2X7。P2Y2受体促进ATP介导的髓系细胞(树突状细胞及其前体细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)在化疗后进入肿瘤的趋化作用(Fig12.2)。自噬缺陷和CD39过表达的肿瘤在化疗后都不能在肿瘤上积聚髓系细胞，P2Y2的药物抑制也将获得相似的效果。

ATP通过激活P2X7受体来刺激树突状细胞中的NLRP3炎性小体，进而触发白细胞介素-1β(IL-1β)的分泌和肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞对IL-1β的依赖。

事实上，P2Y2或IL1受体的中和以及P2X7、NLRP3或caspase-1的敲除使免疫系统失去了对发生ICD的癌细胞产生保护性免疫反应的能力。

上述细胞外ATP和嘌呤能受体之间的相互作用再次出现在相关临床实验上。

在接受辅助化疗的乳腺癌患者中观察到，缺乏自噬会对局部免疫反应有负面影响，且会导致CD8⁺T淋巴细胞与FOXP3⁺调节性T细胞的比率不佳，这样的观察结果与患者存活率较低有关。

不仅分解ATP的胞外酶，如CD39和编码NT5E基因的胞外5’-核苷酸酶(CD73)的高表达表明与包括乳腺癌和卵巢癌在内的多种不同的癌症的预后很差相关，而且在接受蒽环类药物辅助化疗的部分乳腺癌患者中，P2X7的功能缺失性突变也与预后不良有关。

实验中可通过饥饿处理或非免疫抑制自噬诱导剂刺激细胞自噬、ATP释放以及随后的髓系细胞募集和抗癌免疫反应。这些自噬诱导剂属于“热量限制模拟”(CRMs)类。包括羟基柠檬酸在内的几种CRMs可用于小鼠模型，以提高抗癌免疫监视并增强化疗诱导ICD的抗肿瘤免疫应答，这一策略是否适用于癌症患者还有待证明。

Fig12.2 树突状细胞的ATP依赖性招募和激活。在免疫原性细胞死亡的癌细胞中，细胞自噬依赖于溶酶体分泌的ATP来诱导未成熟树突状细胞(IDCs)的募集和激活。胞外ATP作用于亲代谢型P2Y2 和亲离子型P2X7 的嘌呤能受体。P2Y2受体驱动包括未成熟树突状细胞(IDCs)在内的ATP介导的髓系细胞在化疗后向肿瘤的趋化。总而言之，濒死的癌细胞释放的ATP导致了肿瘤床上免疫细胞的富集。P2RX7：嘌呤能受体P2X7；P2RY2：嘌呤能受体P2Y2

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